已有4篇C9orf72 BACs轉基因小鼠模型的報道，均產生RNA灶和DPRs但其中2例未出現ALS/FTD的神經退行性或行為特征。其中只有一個表現出FTD的特征，另一個表現出與ALS和FTD相似的運動缺陷和神經變性。這些來自哺乳動物研究的數據提出了一個問題，即產生RNA灶和DPRs的C9orf72六核苷酸重復擴增是否足以用于疾病的發(fā)病機制。在人類患者，G4C2六核苷酸重復擴增顯著抑制C9orf72蛋白表達，C9orf72基因的敲除導致斑馬魚運動障礙，說明C9orf72單倍體功能不全以及RNA foci和/或DPRs的存在也可能是ALS發(fā)病的危險因素。

我們的結果表明，在KA的存在下，KO大鼠出現進行性運動功能障礙與運動神經元的丟失。提示C9orf72敲除大鼠需要額外的興奮性毒性的刺激來誘發(fā)ALS。肌萎縮性脊髓側索硬化癥(ALS)的大多數病例中都發(fā)現了由興奮性引起的運動神經元興奮毒性的改變。作為一種可能的肌萎縮性脊髓側索硬化癥的常見介質，它可以與其他遺傳因子相互作用，觸發(fā)疾病的發(fā)病機制。我們的研究結果表明，C9orf72功能的喪失和興奮性毒性是誘發(fā)ALS發(fā)病的重要因素。這些結果提示C9orf72單倍體功能不全可能是人類發(fā)病機制的一部分。

C9orf72蛋白能夠與Rab家族的GTPases、RAB7L1、Rab1a、Rab5、Rab8和Rab39、cofilin和SMCR8等多種蛋白相互作用，并活躍于自噬、細胞膜轉運、囊泡轉運和溶酶體生物發(fā)生。在散發(fā)性和家族性肌萎縮性脊髓硬化(ALS)中，高爾基體破碎和核內體異常是神經元細胞體和軸突退行性消失之前的常見病理變化。最近，有報道稱C9orf72單核細胞功能不全破壞了C9orf72 ALS/FTD患者的囊泡轉運和溶酶體生物發(fā)生。我們的研究結果還顯示，KA處理后C9orf72-/-大鼠腰脊髓組織的運動神經元中，早期內泌體、溶酶體和再循環(huán)內泌體的高爾基體復合物嚴重破碎和分散。C9orf72敲除或KA單獨刺激僅引起輕度高爾基體復雜碎片化和囊泡彌散。這一結果提示C9orf72敲除運動神經元可能導致高爾基體的復雜性、易碎性和對其他應力的易感性。RNA測序分析顯示，C9orf72敲除對神經活動相關的基因表達譜產生嚴重干擾，包括神經發(fā)生、周圍神經分化、細胞死亡、神經元投射、囊泡運輸和神經肌肉過程。

綜上所述，我們的數據顯示C9orf72敲除單獨不足以引起ALS發(fā)病機制，但它使運動神經元對其他危險因素如興奮性毒性敏感，在體內協(xié)同作用導致ALS。我們的研究結果也提示C9orf72單倍體功能不全可能是ALS發(fā)病機制之一，提高運動神經元中C9orf72水平可作為一種可能的治療策略進行檢測。

SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK（京）2012-001】。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18003. 本實驗部分使用了基因修飾動物（基因敲除），如果動物逃逸，將會造成的環(huán)境潛在的基因污染。實驗動物飼養(yǎng)繁殖于屏障環(huán)境中，整個實驗過程中保證動物處于監(jiān)管狀態(tài)，無逃脫可能。動物房出入口安放擋鼠板，嚴防動物逃逸，動物籠具一經發(fā)現破損，立即更換，飼養(yǎng)人員出入確保動物房門關緊并鎖住等。含重組DNA的廢棄核酸樣品、離心管、槍頭等用 1M NaOH溶液浸泡后，裝入密封袋中，統(tǒng)一送到化學廢棄物處理公司處理。

1，C9ORF72基因敲除大鼠的建立

2，C9ORF72基因敲除和興奮毒性共同誘導運動缺陷

3，C9ORF72基因敲除和興奮毒性聯(lián)合作用導致運動神經元丟失

4，C9ORF72基因敲除大鼠脊髓免疫熒光染色分析

5，興奮毒性誘導與不誘導的WT和C9orf72敲除大鼠脊髓細胞RNA測序分析

3.1 實驗材料

3.1.1 實驗動物

SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK（京）2012-001】。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18003.

3.1.2實驗儀器

3.1.3實驗試劑

3.1.4模型構建流程

(1) 設計方案

(2) 構建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expression vector，根據基因信息選擇靶點并合成sgRNA。靶點1:ccc caccatctcctgctgttg靶點2:aacggagatcggagcactta cgg(3) 合成的sgRNA單鏈通過退火復性結合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構建完成的sgRNA載體通過體外轉錄成為可注射的sgRNA。(4) 構建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉錄成為可注射的Cas9-RNA。(5) 顯微注射 1) 超數排卵：15只3-4周齡SD雌鼠注射激素進行超排。 2) 受精卵注射：取約150枚受精卵進行注射。 3) 雄鼠結扎：制作30只8周齡輸精管結扎的SD雄鼠。 4) 受體鼠制備：8-10周齡SD雌鼠與結扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。 5) 胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，150枚卵，5只受體鼠）。(6) 基因型鑒定 1) 剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進行編號及取材。 2) 基因組DNA提?。菏褂没蚪MDNA提取試劑盒提取基因組DNA 3) PCR檢測：根據序列信息設計檢測引物并進行PCR檢測。(7) 結果分析：選取通過PCR檢測后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號，將PCR產物進行TA克隆，之后用檢測引物進行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。(8) 根據測序結果確定C9ORF72基因敲除模型大鼠（SD. C9ORF72 (tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后續(xù)實驗。

一、疾病概述

肌萎縮側索硬化（ALS）也叫運動神經元?。∕ND），后一名稱英國常用，法國又叫夏科（Charcot）病，而美國也稱盧伽雷（Lou Gehrig）病。我國通常將肌萎縮側索硬化和運動神經元病混用。它是上運動神經元和下運動神經元損傷之后，導致包括球部（所謂球部，就是指的是延髓支配的這部分肌肉）、四肢、軀干、胸部腹部的肌肉逐漸無力和萎縮?；疾÷始s為4-6/10萬。大約10%的ALS病例是家族型的，90%是散發(fā)型的。

2018年5月11日，國家衛(wèi)生健康委員會等5部門聯(lián)合制定了《第一批罕見病目錄》，肌萎縮側索硬化被收錄其中。

病因

肌萎縮側索硬化的病因至今不明。20%的病例可能與遺傳及基因缺陷有關。另外有部分環(huán)境因素，如重金屬鋁中毒等，都可能造成運動神經元損害。產生運動神經元損害的原因，目前主要理論有：神經毒性物質累積，谷氨酸堆積在神經細胞之間，久而久之，造成神經細胞的損傷；自由基使神經細胞膜受損；神經生長因子缺乏，使神經細胞無法持續(xù)生長、發(fā)育。

臨床癥狀

該病早期癥狀輕微，易與其他疾病混淆?；颊呖赡苤皇歉械接幸恍o力、肉跳、容易疲勞等一些癥狀，漸漸進展為全身肌肉萎縮和吞咽困難。最后產生呼吸衰竭。

依臨床癥狀大致可分為兩型：

1.肢體起病型

癥狀首先是四肢肌肉進行性萎縮、無力，最后才產生呼吸衰竭。

2.延髓起病型

先期出現吞咽、講話困難，很快進展為呼吸衰

診斷

要早期診斷肌萎縮側索硬化，除了神經科臨床檢查外，還需做肌電圖、神經傳導速度檢測、血清特殊抗體檢查、腰穿腦脊液檢查、影像學檢查，甚至肌肉活檢。

1.病史采集和神經系統(tǒng)檢查

診斷過程的第一個重要步驟，就是由神經科醫(yī)生進行的臨床接診。進行包括詳細的現病史，家庭史，工作和環(huán)境接觸史的采集。接診過程中，神經科醫(yī)生將尋找肌萎縮側索硬化的典型表現：

（1）檢查要評估咀嚼和吞咽的肌肉力量，包括口腔、舌及咽喉肌。

（2）下運動神經元（LMN）功能，如肌肉萎縮情況，肌肉力量或肌肉跳動（稱為肌束震顫）。

（3）上運動神經元（UMN）功能，如腱反射亢進和肌肉痙攣（肌肉緊張和僵直的程度）

（4）情緒反應失去控制，如哭或笑的情緒變化。思維的變化如喪失判斷力或失去基本的社會技能。檢查者也會評估患者言語流暢性及文字識別能力。這些癥狀不常見，不容易引起重視。

（5）神經科醫(yī)生還將詢問如疼痛，感覺喪失或錐體外系問題。

2.輔助檢查

診斷過程的下一步往往是一系列的輔助檢查，如頸部MRI（磁共振成像）、頭和腰MRI，EMG（肌電圖）、神經傳導速度和血液化驗。有時會做基因檢測或腰椎穿刺。

（1）磁共振成像（MRI）是一種無痛、非侵入性的檢查，能非常詳細提供脊髓和環(huán)繞、保護脊髓的骨骼及結締組織的結構。將有助于除外對脊髓或主要神經的壓迫（如突出的椎間盤）、多發(fā)性硬化、骨腫瘤壓迫神經等異常、脊髓或腦中風。

（2）肌電圖（EMG）是診斷過程一個非常重要的部分。該檢查有時不舒服，但有必要完成。第一部分通過小型電極在特定部位發(fā)送刺激經過所檢測的神經，在另一部位接受信號。根據所需時間測定傳導速度以判斷是否有神經損傷。第二部分測試選定肌肉的電活動。通過很細的針插入到選定的肌肉，并用它來“聽”這些肌肉的電活動模式。

（3）血液、尿液和其他檢查驗血是為了篩查其他疾病，有些疾病癥狀類似肌萎縮側索硬化早期跡象。這些檢查包括甲狀腺或甲狀旁腺疾病、維生素B12缺乏、艾滋病毒感染、肝炎、自身免疫性疾病以及某些類型的癌癥。肌酸激酶（CK）是肌肉受傷或死亡釋放的酶，也常檢查。其他還包括自身免疫抗體、抗-GM1抗體檢測，尋找可能與某些癌癥有關的血液標志物。根據患者工作和環(huán)境，也可能做重金屬檢測。如果家庭里其他成員患肌萎縮側索硬化應該做肌萎縮側索硬化基因檢測。有時可能需要腰穿。有些患者除無力外，有疼痛或肌酸磷酸激酶（CK）非常高的表現，可能需要肌肉活檢。

3.診斷

這些檢查完成后，有經驗的神經科大夫就可以判斷患者是否為肌萎縮側索硬化。有時確診所需要的癥狀和檢查結果并非都異常（尤其是在疾病的最早階段）。在這種情況下，神經科大夫會檢查建議隨診，3個月后重復體檢和肌電圖。

二、模型背景

1、基因信息

C9ORF72基因,Gene ID: 313155。

2、實驗動物背景信息

SD大鼠

3、研究背景

肌萎縮側索硬化癥（ALS）是一種累進性神經退行疾病，以控制肌肉收縮的上、下運動神經元選擇性退化和凋亡為特征，引發(fā)癱瘓、最終導致死亡，患病率約為4-6/10萬。大約10%的ALS病例是家族型的，90%是散發(fā)型的。從發(fā)現SOD1基因突變到現在，共確定了30余種致病基因，其中C9orf72，FUS，TARDBP，SOD1等比例較高，而EPHA4， ATXN2等20余種基因比率較低[1-5]。肌萎縮側索硬化癥病因涉及興奮毒性、氧化應激、神經營養(yǎng)因子、自身免疫、中毒、感染等，目前無有效的治療方法，仍然是 “不治之癥”。

已發(fā)現的30種致病基因和修飾基因與ALS的病理發(fā)生有關，其機制可歸納為細胞表面受體、RNA加工、蛋白質合成、能量代謝、內質網功能、軸突轉運等幾個方面的異常。其中C9orf72和EPHA4分別參與了RNA加工、內質網、細胞膜受體三種ALS的發(fā)病機制。

C9orf72的第一外顯子E1a和E1b之間有GGGGCC六個堿基的重復序列（HRE)，HRE拷貝數在人群中具有多態(tài)性，高于30個重復會有發(fā)生額顳葉癡呆（FTD）或ALS，在西方人群HER引起的ALS占了家族型病例的40%和散發(fā)型病例的7-10%， 臺灣漢人中分別為18% 和2%， 我國目前研究較少，128個ALS-FTD 病人中發(fā)現2例[7-8]。可能漢人的頻率比西方人低，但總體上仍然是最主要的致病基因，除次之外，HRE引起 30% 的FTD和1-2%的老年性癡呆（AD） [9]，我國的研究發(fā)現，HER結構也可能是帕金森的危險因素。C9orf72是與多種退行性神經疾病相關的重要致病基因和靶點。

C9orf72蛋白與細胞運輸和自噬有關，敲低斑馬魚的C9orf72表達可干擾神經分支的形成和縮短運動神經元軸突[10，11]，推測HER導致ALS的致病機制有二個方面（1）HRE結構導致C9orf72轉錄子在細胞內的積累并與DNA形成RNA/DNA 雜交環(huán)（R-loop）引起RNA毒性；或導致不需要ATG的翻譯（RANtranslation ）甘胺酸/精氨酸或脯氨酸/精氨酸的多肽的細胞毒性；（2） C9orf72表達水平降低影響了神經元內細胞運輸[12-14]。

ALS動物模型是研究ALS的病因、病理、發(fā)病機制和治療的重要工具。目前建立ALS的嚙齒類動物模型主要是SOD1、TDP-43、VCP、FUS等基因的轉基因或基因敲除小鼠，wobbler自發(fā)突變小鼠，不同模型病理表現不同，并各自局限性[15-17]。目前常用的嚙齒類動物模型只反映了10%左右的病因，需要覆蓋更廣泛病因的和基因敲入動物模型的研制。

ALS之所以仍然是臨床的“不治之癥”的主要原因是其病因多樣，目前對其機制了解少，針對性的發(fā)展相應的治療靶點和藥物比較困難。ALS疾病模型的不足也是ALS研究的限制限制因素之一。目前比較常用的模型綜合起來涵蓋的致病機制不超過10%。 建立能覆蓋較大部分發(fā)病機制的ALS模型，可以極大地促進起發(fā)病機制研究、藥物研發(fā)和治療方法研究。

HRE序列多態(tài)性和基因缺失是目前國際公認的最普遍的ALS治病基因。在斑馬魚中敲低C9orf72基因和在果蠅中表達HER序列都能造成一定的神經表型，但與患者的基因結構不同，不能再現ALS表型[11，12]。將HER-GFP表達盒轉入小鼠并沒有ALS表型[18]，啟示將HER結構敲入到C9orf72位點是造成ALS表型所必需的，但C9orf72的HER結構敲入和C9orf72敲除的哺乳動物模型尚未研制成功。

大鼠在生理、行為、神經等研究最常用的實驗動物[21]，大鼠神經系統(tǒng)疾病模型不僅有好的行為學表現，也能表現一些在小鼠模型上不能表現的病理改變。我們推測C9ofr72基因修飾大鼠模型將比小鼠有更好的表型。 而我們實驗室在國際上率先建立了系統(tǒng)的CRISPR/cas9 介導的、率的大鼠基因條件敲除、敲入技術體系[22]，建立C9ofr72基因修飾大鼠沒有技術障礙。

綜上，ALS影響的不僅僅是病人，也是對社會和家庭影響很大的“不治之癥”，而目前國際上尚未建立基于C9orf72基因的哺乳類動物模型建立這類模型對我國ALS、FTD和AD等神經退行性疾病的醫(yī)藥研究具有重要的推動作用。

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