較之前的抗疲勞保健品評價方法中直接選用正常小鼠進行給藥檢測，該實驗增加束縛應(yīng)激進行造模，模擬當(dāng)今社會由于長時間伏案工作、缺乏運動等情況所致的疲勞。ICR小鼠每天接受8h束縛，分別束縛5d、10d和15d，隨后進行與疲勞相關(guān)的行為學(xué)檢測。在負重游泳檢測中除采用原唯一評價指標“力竭時間”，增設(shè) “首次連續(xù)下沉?xí)r刻”作為早期出現(xiàn)指標，印證負重游泳情況，相較更加敏感且動物友好。根據(jù)臨床中疲勞人群主動運動的意愿降低的現(xiàn)象，增加空場實驗，檢測CRS疲勞小鼠的自主活動距離和時間。通過抓力測試評價其肌肉力量，反應(yīng)疲勞發(fā)生情況。

在CRS5d小鼠行為學(xué)檢測表現(xiàn)出一定體力疲勞趨勢，CRS10d小鼠負重游泳中力竭時間顯著縮短、首次連續(xù)下沉?xí)r刻提前并且抓力降低，均表現(xiàn)出疲勞現(xiàn)象，這可以反應(yīng)每天8h，持續(xù)10dCRS即可導(dǎo)致體力疲勞。相比CRS 10d小鼠，CRS 15d在負重游泳、空場和抓力檢測中疲勞更為穩(wěn)定。通過生化指標的檢測，從代謝產(chǎn)物堆積、能量物質(zhì)耗竭和氧化應(yīng)激三個方面對CRS造模后小鼠疲勞狀態(tài)進行分析，其在15d時疲勞生化指標更為穩(wěn)定。故得出束縛造成小鼠體力疲勞模型需要連續(xù)15d，每天束縛8h造模效果更為穩(wěn)定。

本研究用所建立的疲勞模型構(gòu)建方法（每天8h，連續(xù)束縛15d）在C57BL/6N和BALB/C兩種常用小鼠上進行了驗證，探究其疲勞建模方法的種屬適用性。實驗發(fā)現(xiàn)C57BL/6N和BALB/C小鼠均表現(xiàn)出負重游泳力竭時間縮短和抓力降低等行為表現(xiàn)，表明連續(xù)15天，每天束縛8小時可以造成普遍的小鼠疲勞模型。

1.評價指標體系

1）負重游泳實驗：以“力竭時間”和“首次連續(xù)下沉?xí)r間”作為動物體力的評價指標。時間越短表明動物的體力越差，反之亦然。

2）抓力實驗：以“前肢抓力”作為動物肌肉力量的評價指標，抓力越大體力越強。

3）自主活動：以“運動距離”、“運動總路程”、“運動時間”作為動物體力評價指標，數(shù)值越大表明體力越好。

4）生化指標：

(1) 肝糖原：以“肝糖原”含量越高，表明其儲備能源越多，在運動中體力越好。

(2) 血乳酸：以運動后血清中“乳酸”含量越低，表示其代謝產(chǎn)物的堆積越少，越不易疲勞。

(3) 血糖：以運動后血清中“血糖含量越高，表明其可利用能源物質(zhì)剩余越多，體力越好。

(4) 乳酸脫氫酶：以運動后血清中“乳酸脫氫酶”活力越強，表明其細胞受到氧化應(yīng)激損傷越嚴重。

2. 國內(nèi)外現(xiàn)有模型的異同

截止目前為止，國內(nèi)外文獻中已報道的造成體力疲勞動物模型的方法有：強迫運動、應(yīng)激、化學(xué)、免疫和炎癥、放射線、手術(shù)、基因工程和癌因等單一因素或多種因素誘導(dǎo)的方法構(gòu)建的一系列用于疲勞研究的動物模型。而在這些方法中，強迫運動法是最為常用的造成體力疲勞的方法，如強迫游泳、轉(zhuǎn)輪攀爬、跑步等。除此之外，文獻中亦有采用束縛、睡眠干擾、或多種刺激因素相結(jié)合的（電擊、冰水刺激、噪聲刺激）應(yīng)激方法導(dǎo)致的動物疲勞。如：Tanaka等對SD大鼠進行睡眠干擾5天，就可導(dǎo)致其負重游泳力竭時間縮短等疲勞樣行為；Park等[9]將雄性C57BL/6J小鼠置于與其緊密接觸且無法活動的圓柱形束縛器（長10 cm，直徑3 cm）中，每天束縛3 h，共15天可造成小鼠在空場中自主活動降低和強迫游泳不動時間延長等疲勞癥狀。Zou等采用電擊、冰水游泳和束縛刺激多因素刺激23天造成SD大鼠轉(zhuǎn)輪運動降低、自主活動減少等疲勞現(xiàn)象[9]；Shao等采用束縛、強迫運動、擁擠環(huán)境飼養(yǎng)和嘈雜聲中暴露4種方法想結(jié)合成功誘導(dǎo)了SD大鼠的疲勞模型；Zhao等采用睡眠剝奪、強迫游泳、束縛和夾尾造成小鼠負重游泳力竭時間縮短和空場自主活動降低等疲勞癥狀。盡管這些誘導(dǎo)疲勞的方法能夠模擬當(dāng)今人們因繁重工作和生活壓力導(dǎo)致的體力疲勞，但因考慮因素多、操作復(fù)雜，不易控制，并且對造模過程沒有進行動態(tài)觀察和比較，不能判斷動物出現(xiàn)疲勞現(xiàn)象的最佳時機。此外，對慢性束縛應(yīng)激所致的分子機制研究亦很有限。

3. 技術(shù)難點

（1）束縛器的選擇。本實驗室采用自制束縛器，束縛器長度為6-8.5 cm（可根據(jù)動物體積調(diào)節(jié)），內(nèi)徑為3 cm，周身有多個直徑為0.5 cm 的通氣孔。既保證了動物的自主呼吸，又能保證動物不會掙脫束縛器。為造模成功提供了基礎(chǔ)。

（2）造模時長的選擇。綜合了前期文獻調(diào)研和本實驗室的實驗基礎(chǔ)，采用了每天束縛8h（10: 00～18: 00），分別束縛5d、10d和15d進行比較。

（3）動物的選擇。本實驗采用了常用的ICR小鼠進行實驗，為了驗證不同品系小鼠對實驗結(jié)果的影響，因此本實驗又選擇了C57BL/6N和BALB/C兩種小鼠進行了比較。

4. 創(chuàng)新性

（1）比較了每天束縛8h（10: 00-18: 00），分別束縛5d、10d和15d考察對ICR小鼠疲勞的影響。確立了采用連續(xù)15d、每天束縛8h 可以建立更穩(wěn)定、更有效的動物疲勞模型。并且驗證了該條件同樣也適用于C57BL/6N和BALB/C小鼠。

（2）揭示了該疲勞的發(fā)生與腓腸肌肌肉功能障礙有關(guān)。腓腸肌肌肉功能障礙可能涉及由AMPK信號通路介導(dǎo)的肌肉線粒體功能損傷以及自噬受阻的能量代謝失衡而產(chǎn)生。

5. 應(yīng)用價值

采用慢性束縛應(yīng)激的方法，將動物限制在狹窄空間內(nèi)無法自由活動而造成體力疲勞，能很好地模擬當(dāng)今人們因長期應(yīng)激所導(dǎo)致的“亞健康”狀態(tài)的體力疲勞狀態(tài)，如長期伏案或在有限空間內(nèi)工作、缺少運動、睡眠不足、以及工作和生活所帶來的生理和心理壓力等。因此，該模型為緩解體力疲勞保健的功效評價提供了一個已操作、穩(wěn)定可控的動物模型。

動物飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所的屏障環(huán)境，12 h 照明/12 h 黑暗( 照明: 8: 00-20:00) ，飼養(yǎng)期間給予動物標準飼料和潔凈飲水。本動物實驗遵守國際實驗動物倫理學(xué)要求。

3實驗結(jié)果3.1 不同CRS周期對ICR小鼠體重的影響

如圖1所示，與空白組相比在接受后，CRS小鼠在應(yīng)激下體重將發(fā)生一定程度的降低。經(jīng)過幾天的束縛，小鼠適應(yīng)應(yīng)激后體重開始穩(wěn)定增長，但仍然顯著低于空白組。最后不同束縛天數(shù)的小鼠體重趨于相近，但CRS 15d小鼠仍低于其余小鼠。

圖1 不同周期下CRS對ICR小鼠體重的影響。（n＝12，Mean ± SEM）。

3.2 不同CRS天數(shù)對ICR小鼠負重強迫游泳的影響

由圖2可見，在負重強迫游泳過程中，與空白組相比不同周期CRS下ICR小鼠均表現(xiàn)出一定程度的疲勞狀態(tài)，其力竭游泳時間均縮短。CRS5d小鼠力竭時間具有縮短趨勢，CRS10d和15d小鼠力竭時間顯著縮短（P<0.01，P<0.01）。與CRS10d相比CRS 15d小鼠疲勞程度進一步加深。

圖2不同周期下CRS對ICR小鼠負重游泳力竭時間的影響。（n＝12，Mean ± SEM），**P＜0.01。

因首次下沉?xí)r刻出現(xiàn)過早，且小鼠間游泳習(xí)慣可能存在較大差異，在作為評價指標時易出現(xiàn)誤判。故我們提出首次連續(xù)下沉?xí)r刻這一指標，首次連續(xù)下沉?xí)r刻為動物從負重游泳開始直到連續(xù)在短時間內(nèi)下沉2次及以上的時刻。如圖3所示，CRS會引起小鼠負重游泳時的首次連續(xù)下沉?xí)r刻提前，5、10和15dCRS應(yīng)激均能顯著降低ICR小鼠的首次連續(xù)下沉?xí)r刻（P<0.01，P<0.01，P<0.001）。CRS5d小鼠的負重游泳首次連續(xù)下沉?xí)r刻已顯著提前，且該指標比力竭時間可能更為敏感。

圖3不同周期下CRS對ICR小鼠負重游泳首次連續(xù)下沉?xí)r刻的影響。（n＝12，Mean ± SEM），**P＜0.01; ***P＜0.001。

3.3 不同CRS天數(shù)對ICR小鼠空場自主活動的影響

臨床的觀察中發(fā)現(xiàn)，身體疲勞可能會降低人們在安靜狀態(tài)下主動運動的意愿，我們在空場自主活動中也觀察到了CRS小鼠疲勞發(fā)生的這一變化，并于15d時變化顯著。如圖4所示，CRS會引起小鼠在空場中的自主活動路程和時間降低，在15d時其運動路程顯著降低（P<0.05），且通過中央?yún)^(qū)運動比率可以看出該變化與焦慮等情緒無關(guān)；CRS 10d和15d小鼠的空場運動時間顯著降低(P<0.05，0.05)。

圖4不同周期下CRS對ICR小鼠空場中運動路程與時間的影響。（n＝12，Mean ± SEM），*P＜0.05。

3.4 不同CRS天數(shù)對ICR小鼠抓力的影響

由圖5可見，束縛引起的疲勞同樣能引起小鼠肌肉握力的降低。CRS 5d、10d和15d后小鼠握力均有降低，在5d和15dCRS組中握力顯著下降（P<0.05，P<0.001）。

圖5不同周期下CRS對ICR小鼠抓力的影響。（n＝12，Mean ± SEM），*P＜0.05; ***P＜0.001。

3.5 不同CRS天數(shù)對ICR小鼠疲勞相關(guān)生化指標的影響

如圖所示，通過對小鼠束縛引起疲勞模型后對其血清和肝臟進行疲勞相關(guān)生化指標檢測，得到其肌糖原、肝糖原含量以及血清中血糖（Glu）、乳酸（LA）、肌酐（Cre）、尿素（Urea）、乳酸脫氫酶（LDH）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平。

在劇烈運動后會產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，引起LA、Cre和Urea等大量堆積從而產(chǎn)生疲勞。如圖6所示，檢測發(fā)現(xiàn)三組不同天數(shù)CRS小鼠游泳后的LA堆積均高于空白組，CRS10d和15d小鼠LA水平顯著高于空白組（P<0.001，P<0.001）。在運動中肌酸在肌肉內(nèi)供能，Cre為肌酸的終末代謝產(chǎn)物，疲勞小鼠中Cre將會升高。CRS后小鼠血清Cre含量均能被升高，在CRS10d和15d后，其Cre水平顯著升高（P<0.001，P<0.01）。尿素是蛋白質(zhì)分解代謝的產(chǎn)物，劇烈運動時供能不足，進一步蛋白質(zhì)也會被分解供能，小鼠尿素升高。CRS組相比于空白組BUN水平均具有升高趨勢，其中CRS15d小鼠Urea顯著升高（P<0.05）。

圖6 不同周期下CRS對ICR小鼠血清乳酸、肌酐以及尿素的影響。（n＝12，Mean ± SEM），*P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001。

糖是運動的主要能量來源，機體通過糖的有氧氧化和無氧氧化產(chǎn)生能量生成ATP，機體疲勞往往伴隨著糖類能源物質(zhì)耗竭產(chǎn)生。如圖7所示，CRS小鼠的能源物質(zhì)水平進一步下降，游泳運動后相比于空白組，CRS5d、10d和15d小鼠Glu水平均顯著降低（P<0.001，P<0.001，P<0.001）。CRS5d、10d和15d小鼠肝糖原水平也均顯著降低（P<0.001，P<0.05，P<0.05）。其肌糖原水平均顯著升高（P<0.01，P<0.01，P<0.05），該變化可能因其運動中肌肉利用肌糖原進行糖酵解，產(chǎn)生更多乳酸堆積進而抑制其肌糖原的利用。

圖7 不同周期下CRS對ICR小鼠血糖及肝糖原的影響。（n＝12，Mean ± SEM）， * P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001。

劇烈運動后產(chǎn)生大量自由基，通過氧化應(yīng)激損傷機體，且AST在心肌細胞中含量較多。由圖8可知，氧化應(yīng)激引起心肌細胞損傷，CRS小鼠運動后與空白組小鼠相比，血清AST增高，在CRS10d和15d小鼠中其水平顯著升高（P<0.05，P<0.01）。在劇烈運動后肌肉細胞因氧化應(yīng)激被破壞，LDH會滲入血中，CRS10d和15d小鼠LDH含量與空白組相比均顯著升高（P<0.05，P<0.05）。

圖8 不同周期下CRS對ICR小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶的影響。（n＝12，Mean ± SEM），*P＜0.05; ** P＜0.01。

3.6 CRS致小鼠腓腸肌肌肉萎縮

為了研究CRS誘導(dǎo)小鼠疲勞發(fā)生的機制，我們對與運動耐力直接相關(guān)的骨骼肌進行了研究。如圖9所示，與對照組相比，CRS處理15天后小鼠的腓腸肌重量顯著下降。通過H&E染色觀察腓腸肌，對照組小鼠腓腸肌肌纖維組織清晰、排列整齊，而CRS小鼠腓腸肌肌纖維形狀不規(guī)則、嚴重分裂形成多角型萎縮。定量分析顯示，CRS小鼠肌纖維的直徑和橫截面積顯著減少。數(shù)據(jù)表明，CRS可造成小鼠肌肉質(zhì)量降低并使肌纖維結(jié)構(gòu)受損。

圖9 CRS致小鼠腓腸肌萎縮（Mean ± SEM）。（a）小鼠腓腸肌組織解剖圖；（b）腓腸肌質(zhì)量；（c）代表性的腓腸肌H&E染色圖，比例尺：上圖500 μm，下圖100 μm；（d）和（e）腓腸肌纖維直徑和橫截面積（n＝3）。***P＜0.001。

3.7 CRS小鼠腓腸肌轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

為了系統(tǒng)地研究CRS對小鼠肌肉疲勞產(chǎn)生的影響，通過轉(zhuǎn)錄組測序分析了對照組和CRS處理15天小鼠的腓腸肌。在對照組與CRS組中共發(fā)現(xiàn)了239個差異表達基因（DEGs）。其中CRS顯著上調(diào)了195個基因，顯著下調(diào)了44個基因(圖10a)。KEGG富集分析結(jié)果表明6-磷酸葡萄糖流向PPP，導(dǎo)致脂肪酸代謝代償性上調(diào)，以提供能量。與碳代謝相關(guān)的途徑，如戊糖磷酸途徑(PPP)、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))和丙酮酸代謝等被富集(圖10c)。并且結(jié)果顯示，與能量代謝密切相關(guān)的AMPK信號通路受到顯著調(diào)控。基于KEGG結(jié)果的熱圖顯示，與AMPK信號通路、脂肪酸代謝和碳代謝相關(guān)的基因均受到CRS處理的顯著調(diào)控(圖10b)。GO分子功能分析表明，氧化還原酶等分子活性被富集；細胞成分分析顯示，這些DEGs大量編碼線粒體蛋白；并且在生物過程中也富集了許多脂質(zhì)代謝過程相關(guān)的代謝途徑(圖10d)。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，CRS致小鼠疲勞的原因與碳代謝、脂代謝途徑紊亂有關(guān)，并與主要供能細胞器線粒體及調(diào)控能量代謝的AMPK信號通路密切相關(guān)。

圖10 通過RNA-Seq分析CRS對小鼠腓腸肌基因表達的影響（mean ± SEM，n=3）。（a）腓腸肌中239個特異性DEGs的火山圖；（b）DEGs的KEGG富集分析；（c）AMPK信號通路、脂肪酸代謝和碳代謝相關(guān)的DEGs表達熱圖; （d）DEGs的GO富集分析。

3.8CRS誘導(dǎo)腓腸肌線粒體缺失和功能障礙與AMPK信號通路相關(guān)

線粒體在調(diào)節(jié)肌細胞能量供應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用。轉(zhuǎn)錄組測序分析的結(jié)果推測線粒體參與了CRS所導(dǎo)致的肌肉功能障礙。為了進一步驗證該結(jié)果，我們通過透射電鏡觀察腓腸肌的超微結(jié)構(gòu)。觀察發(fā)現(xiàn)對照組小鼠腓腸肌線粒體形態(tài)標準，分布均勻；而CRS小鼠腓腸肌線粒體片段化、分布不均，線粒體總數(shù)減少。

線粒體標志蛋白CYT-C和TOMM20的表達降低表明CRS顯著減少了線粒體的數(shù)量(圖11b)。此外，對氧化磷酸化蛋白（OXPHOS）進行檢測，發(fā)現(xiàn)UQCRC2水平的顯著下降表明氧化磷酸化呼吸鏈受到抑制。通過免疫組化染色觀察小鼠腓腸肌發(fā)現(xiàn)CRS小鼠MHY7表達顯著降低，同樣CRS處理使腓腸肌MYH7蛋白表達顯著降低，揭示了CRS減少了富含線粒體的I型骨骼肌纖維。

圖11CRS對小鼠腓腸肌線粒體功能障礙的影響（mean ± SEM，n=3）。（a）腓腸肌的透射電鏡圖；（b）腓腸肌中CTT-C、TOMM20、OXPHOS免疫印跡分析；（c）免疫印跡分析腓腸肌MYH7；（d）腓腸肌MYH7免疫組化染色，比例尺100 μm；（e-h）MYH7/GAPDH、CTT-C/GAPDH、TOMM20/GAPDH和UQCRC2/GAPDH的定量分析。*P＜0.05。

AMPK可以通過調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生、融合/分裂和供能參與線粒體質(zhì)量控制。為了闡明CRS誘導(dǎo)的肌肉和線粒體功能障礙是否與AMPK有關(guān)，我們測定了相關(guān)蛋白的表達。如圖所示，與正常組相比，CRS引起小鼠腓腸肌p-AMPK/AMPK的水平顯著降低。并對其下游的主要蛋白進行免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)PGC-1α及其下游因子TFAM的表達也顯著降低。因此，CRS誘導(dǎo)的腓腸肌線粒體功能障礙與AMPK/PGC-1α信號通路受阻相關(guān)。

圖12CRS對小鼠腓腸肌AMPK信號通路的影響（mean ± SEM，n=3）。（a）腓腸肌中p-AMPK、AMPK、PGC-1α和TFAM的免疫印跡分析；（b-d）p-AMPK/AMPK、PGC-1α/GAPDH和TFAM/GAPDH的定量分析。*P＜0.05，**P＜0.01。

3.9CRS對腓腸肌線粒體自噬的影響

線粒體自噬是清除受損線粒體的一種重要的線粒體質(zhì)量控制機制。與對照組相比，CRS處理后PINK1和LC3表達降低，p62表達升高，表明腓腸肌線粒體自噬受阻，線粒體受損并聚積。

進一步對AMPK/mTOR信號通路進行研究，探究其線粒體自噬受阻的原因。在CRS誘導(dǎo)的小鼠中，p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR表達顯著升高，p-ULK1 (Ser757)表達上調(diào)，導(dǎo)致ULK1與AMPK間的相互作用被破壞。綜上所述，CRS致小鼠腓腸肌AMPK激活受阻，從而使mTOR途徑異常激活抑制保護性線粒體自噬的發(fā)生。

圖13 CRS對腓腸肌線粒體自噬的影響（mean ± SEM，n=3）。（a）腓腸肌中PINK1、LC3和p62的免疫印跡分析；（b）p-AKT/AKT (f)、p-mTOR/mTOR (g)和p-ULK1 (Ser757) 的免疫印跡分析；（c-h）PINK1/GAPDH、LC3-Ⅱ/GAPDH、p62/GAPDH、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和p-ULK1 (Ser757)/GAPDH的定量分析。*P＜0.05，**P＜0.01。

3.10蓮須提取物對CRS小鼠負重游泳的影響

結(jié)果如圖所示，與空白對照組相比，模型組小鼠在CRS處理15天后負重游泳首次連續(xù)下沉?xí)r刻顯著延后。紅景天和蓮須給藥各組較模型組首次連續(xù)下沉?xí)r刻延長，且蓮須給藥組的低和高劑量組與模型組相比有顯著性差異。在游泳耐力上，較空白對照組相比，模型組力竭時間顯著縮短。紅景天何蓮須給藥各組較模型組力竭時間延長，且蓮須給藥組的高劑量組與模型組相比顯著提高。

圖14 蓮須提取物對CRS小鼠負重游泳首次連續(xù)下沉?xí)r刻和力竭時間的影響。（n＝10-12，Mean ± SEM），與正常組相比，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組相比，p<0.05，#p<0.001。LSL：thelowdoseofLotus Stamen，蓮須低劑量組（0.5 g/kg），LSH：thehighdoseofLotus Stamen，蓮須高劑量組（1g/kg），Rho：Rhodiola，紅景天組。

3.11蓮須提取物對CRS小鼠抓力的影響

結(jié)果如圖所示，在造模15天后，與空白對照組相比，模型組小鼠在CRS刺激15天后抓力顯著降低。蓮須和紅景天給藥各組較模型組抓力均顯著升高。

圖15 蓮須提取物對CRS小鼠抓力的影響。（n＝12，Mean ± SEM），與正常組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#p<0.05。LSL：thelowdoseofLotus Stamen，蓮須低劑量組（0.5 g/kg），LSH：thehighdoseofLotus Stamen，蓮須高劑量組（1g/kg），Rho：Rhodiola，紅景天組。

3.12蓮須提取物對CRS小鼠疲勞相關(guān)生化指標的影響

結(jié)果如圖所示，在造模15天后，與空白對照組相比，模型組小鼠在CRS刺激15天后血清Glu顯著降低，LDH、LA和CORT顯著升高。蓮須和紅景天給藥各組較模型組抓力均能顯著恢復(fù)。

圖16 蓮須提取物對CRS小鼠疲勞相關(guān)生化指標的影響。（Mean ± SEM），與正常組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#p<0.05。LSL：thelowdoseofLotus Stamen，蓮須低劑量組（0.5 g/kg），LSH：thehighdoseofLotus Stamen，蓮須高劑量組（1g/kg），Rho：Rhodiola，紅景天組。

1 實驗材料 1.1實驗動物

ICR雄鼠12x4=48只（購自北京市維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），4周齡，體重21-23g，許可證號：SCXK（京）2017-0020。動物購入后于SPF級動物房中飼養(yǎng)。自由進食給水，保持實驗室安靜，實驗室溫度22-25oC，濕度50-60%，明暗周期12h/12h。

1.2實驗材料

乳酸（LD）試劑盒（南京建成：20191102）；肌／肝糖原試劑盒（南京建成：20191102）；乳酸脫氫酶測定試劑盒（中生北控：190771）；葡萄糖測定試劑盒（中生北控：190871）；肌酐測定試劑盒（中生北控：190721）；尿素測定試劑盒（中生北控：190971）；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒（中生北控：190841）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒（中生北控：190821）。

小鼠束縛器（直徑3cm，長度7.5cm）；小鼠負重游泳測試分析系統(tǒng)（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所）；大小鼠抓力儀（YLS-13A，濟南益延科技發(fā)展有限公司）；小鼠自主活動計算機在線檢測系統(tǒng)（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所）；酶標儀；全自動生化儀（Beckman AV480）。

2 實驗方法 2.1分組及實驗

適應(yīng)性飼養(yǎng)4d，根據(jù)體重將動物隨機分為以下4組（n=12）。①組為空白組，④組于第1d開始進行束縛，③組于第6d開始進行束縛，②組于第11d開始進行束縛。于第16d各組分別完成0、5、10、15d的慢性束縛應(yīng)激，各組動物于同一天進行行為學(xué)檢測。

CRS組每天束縛8小時（12:00-20:00）。實驗期間記錄小鼠體重，在第16d進行空場檢測及負重強迫游泳，次日進行抓力測試和取材。

2.2行為學(xué)檢測 2.2.1抓力測試（Gripstrength）

第16天測試小鼠前肢肌肉力量。將小鼠置于大小鼠握力儀上，小鼠前肢握住握力儀，輕輕牽拉小鼠尾部，將會產(chǎn)生反作用力。逐漸增大拉力直到動物松爪，握力儀高精度力量傳感器將會記錄下最大拉力，每只小鼠測量3次取平均值。

2.2.2空場實驗（Open-field）

將小鼠放入自主活動測試儀（長寬各30 cm，高60 cm）中適應(yīng)環(huán)境3min，然后開始記錄其在5min內(nèi)的活動總路程、運動路程、運動時間、平均速率、中央?yún)^(qū)運動路程比率等指標。

2.2.3負重游泳實驗（Exhaustive swimming test）

小鼠負重游泳測試分析系統(tǒng)通常用來測試小鼠疲勞情況，通過負重后在水中的游泳行為來考察其體力情況。儀器包括電腦、水箱、攝像頭三個部分，負重游泳測試系統(tǒng)共四個泳道，可供4只小鼠同時進行實驗。

第16天將小鼠置于獨立自動檢測的游泳箱中游泳，水溫(25±0.5)°C，水深≥25cm。將小鼠尾部附上8%重量后，通過前端和上方兩個攝像頭實時記錄小鼠自游泳開始至力竭時間段內(nèi)的行為。小鼠頭部沉入水中后7s仍不能返回水面時，判斷為力竭，測試終止。記錄首次下沉?xí)r間、首次連續(xù)下沉?xí)r刻、下沉次數(shù)、水上以及水下運動時間和不動時間以及力竭時間等。游泳結(jié)束后，立即撈出小鼠，擦干小鼠身上的水分，放回原來的籠中。

2.3 取材及生化檢測

準確計時游泳30min后，休息30min，然后在戊巴比妥鈉麻醉下取血、肝臟、肌肉（腓腸肌）組織用于后期生化指標測量。取得血靜置4h后，3500r/ min，15min離心得血清。

使用南京建成乳酸試劑盒，肌／肝糖原試劑盒按照試劑盒內(nèi)說明書方法操作對血清乳酸以及肝臟進行檢測，得到所有小鼠的血乳酸、肌糖原和肝糖原含量。使用中生北控乳酸脫氫酶測定試劑盒；葡萄糖測定試劑盒；肌酐測定試劑盒；尿素測定試劑盒；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒，通過全自動生化儀檢測小鼠血清肌酐（Cre）、尿素（Urea）、血糖（Glu）、乳酸脫氫酶（LDH）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平。

2.4 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果以均數(shù)±標準誤（Mean ± SEM）表示，采用SPSS 25.0進行統(tǒng)計分析，P < 0.05為產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)差異。

1. 目的

通過慢性束縛應(yīng)激的方法，構(gòu)建能夠很好模擬當(dāng)今社會人們所處的工作環(huán)境和生活狀態(tài)而引起的“亞健康”體力疲勞：如長期伏案或在有限空間內(nèi)工作、缺少運動、以及工作和生活所帶來的生理和心理壓力等等，以用于抗體力疲勞藥品和保健品的功效評價。

2. 意義

隨著社會的進步和高速發(fā)展，人們的生活節(jié)奏日益加快，所面臨的社會競爭也隨之加大，長期處在生活和工作壓力下，身體容易出現(xiàn)精力不夠、注意力不集中、疲憊乏力甚至酸痛等的疲勞狀況。當(dāng)今，疲勞已成為廣泛存在且不容忽視的健康問題。隨著生活水平的提高，人們對保健品的需求也在不斷增大，通過服用具有緩解體力疲勞的保健品可以降低或消除機體的疲勞現(xiàn)象，使其體力恢復(fù)到正常。因此, 建立穩(wěn)定的體力疲勞動物模型和功效評價方法就顯得尤為重要。目前常用的方法是采用正常動物通過強迫運動而造成其急性體力疲勞，而非真正的疲勞動物模型。隨著社會的進步，人們的生活習(xí)慣和工作性質(zhì)發(fā)生了很大改變，高自動化的機械設(shè)備替代了原來完全靠人工進行的強體力勞動，因此疲勞的表現(xiàn)也有了很大的不同。本研究采用慢性束縛應(yīng)激(CRS)的方法，將動物限制在狹窄空間內(nèi)無法自由活動而造成體力疲勞，能很好地模擬當(dāng)今人們因長期應(yīng)激所導(dǎo)致的“亞健康”狀態(tài)的體力疲勞狀態(tài)，如長期伏案或在有限空間內(nèi)工作、缺少運動、睡眠不足、以及工作和生活所帶來的生理和心理壓力等。

3. 國內(nèi)外研究進展

國內(nèi)外文獻中已報道的造成體力疲勞動物模型的方法有：強迫運動、應(yīng)激、化學(xué)、免疫和炎癥、放射線、手術(shù)、基因工程和癌因等單一因素或多種因素誘導(dǎo)的方法構(gòu)建的一系列用于疲勞研究的動物模型[1]。而在這些方法中，強迫運動法是最為常用的造成體力疲勞的方法，如強迫游泳、轉(zhuǎn)輪攀爬、跑步等。我國原衛(wèi)生部于2003年印發(fā)的《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003年版）中的“緩解體力疲勞”保健品功能評價方法是采用的負重游泳實驗。除此之外，文獻中亦有采用束縛、睡眠干擾、或多種刺激因素相結(jié)合的（電擊、冰水刺激、噪聲刺激、）應(yīng)激方法導(dǎo)致的動物疲勞[1]。如：Tanaka等對SD大鼠進行睡眠干擾5天，就可導(dǎo)致其負重游泳力竭時間縮短等疲勞樣行為[2]；Park等[3]將雄性C57BL/6J小鼠置于與其緊密接觸且無法活動的圓柱形束縛器（長10 cm，直徑3 cm）中，每天束縛3 h，共15天可造成小鼠在空場中自主活動降低和強迫游泳不動時間延長等疲勞癥狀[3]。為了模擬人們在日常環(huán)境中所受到的復(fù)雜因素影響，可同時使用上述物理方法進行多重刺激從而造成動物疲勞的模型, Zou等采用電擊、冰水游泳和束縛刺激多因素刺激23天造成SD大鼠轉(zhuǎn)輪運動降低、自主活動減少等疲勞現(xiàn)象[4]；Shao等采用束縛、強迫運動、擁擠環(huán)境飼養(yǎng)和嘈雜聲中暴露4種方法想結(jié)合成功誘導(dǎo)了SD大鼠的疲勞模型[5]；Zhao等采用睡眠剝奪、強迫游泳、束縛和夾尾造成小鼠負重游泳力竭時間縮短和空場自主活動降低等疲勞癥狀[6]。盡管這些誘導(dǎo)疲勞的方法能夠模擬當(dāng)今人們的生活工作狀態(tài)，但因為沒有動態(tài)觀察和比較動物出現(xiàn)疲勞現(xiàn)象的最佳時機，造模參數(shù)各異。

我們采用ICR、C57BL/6N或BALB/C雄性小鼠，每天對其束縛8小時、連續(xù)束縛15天可穩(wěn)定造成其體力疲勞，表現(xiàn)在強迫游泳首次連續(xù)下沉?xí)r刻明顯提前、力竭時間顯著縮短、自主活動和抓力明顯降低；肝糖原和血尿素氮水平降低、血乳酸和肌糖原水平升高。并揭示該疲勞的發(fā)生與腸道微生物失衡和犬尿氨酸代謝紊亂、腓腸肌肌肉功能障礙有關(guān)。腓腸肌肌肉功能障礙可能涉及由AMPK信號通路介導(dǎo)的肌肉線粒體功能損傷以及自噬受阻的能量代謝失衡而產(chǎn)生。

參考文獻：

1)王智，閆明珠，夏天吉，劉新民，潘瑞樂，周云豐，陶雪，常琪*. 疲勞的動物模型及發(fā)生機制研究進展. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2021 23(6):1937-1943.

2)Tanaka M, Nakamura F, Mizokawa S, Matsumura A, Nozaki S, Watanabe Y. Establishment and assessment of a rat model of fatigue [J]. Neuroscience Letters, 2003, 352(3):159-162.

3)Park, S. H.; Jang, S.; Lee, S. W.; Park, S. D.; Sung, Y. Y.; Kim, H. K., Akebia quinata Decaisne aqueous extract acts as a novel anti-fatigue agent in mice exposed to chronic restraint stress. J Ethnopharmacol 2018, 222, 270-279.

4)Zou J, Yuan J, Lv S, et al. Effects of exercise on behavior and peripheral blood lymphocyte apoptosis in a rat model of chronic fatigue syndrome [J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2010, 30(2): 258-264.

5)Shao C, Ren Y, Wang Z, et al. Detection of Urine Metabolites in a Rat Model of Chronic Fatigue Syndrome before and after Exercise [J]. Biomed Res Int, 2017, 2017: 8182020.

6)Zhao R, Hao W, Ma B, et al. Improvement effect of Lycium barbarum polysaccharide on sub-health mice [J]. Iran J Basic Med Sci, 2015, 18(12): 1245-1252.