1.評價指標(biāo)體系

1）DAI評分

分值

0

1

2

3

4

體重變化

＞99%

95%-99%

90%-95%

85%-90%

＜85%

糞便形態(tài)

正常

軟便

便不成型

稀便

粘液或水樣便

便血情況

無便血

/

隱血

/

便血

2）生化指標(biāo)：

（1）炎性因子測定：IL-6、IL-1β、TNF-α

（2）HE染色：以結(jié)腸細(xì)胞排列、炎癥浸潤情況、空腔數(shù)作為動物結(jié)腸損傷的評價指標(biāo)，細(xì)胞排列整齊、炎癥浸潤、空腔少表明損傷越小。

2. 國內(nèi)外現(xiàn)有模型的異同

截止目前為止，國內(nèi)外文獻(xiàn)中已報道的造成炎癥性腸病動物模型的方法有：化學(xué)誘導(dǎo)、免疫和炎癥、大腸桿菌誘導(dǎo)等單一因素或多種因素誘導(dǎo)的方法構(gòu)建的一系列用于炎癥性腸病研究的動物模型。

而在這些方法中，化學(xué)誘導(dǎo)是最為常用的造成炎癥性腸病的方法，如飲用DSS、TNBS灌腸、惡唑酮皮膚表面滴注及灌腸等。如：I Okayasu等對小鼠予飲用水中添加一定分子量的DSS，就可導(dǎo)致不同程度的炎癥性腸病模型[2]；取4%~10%的乙酸1.5 mL灌入大鼠結(jié)腸內(nèi)5~8 cm處，10~20 s后用0.9%氯化鈉3~5 mL沖洗1次[3]；取一定量的OXZ乙醇溶液一次性經(jīng)導(dǎo)管(距肛4 cm)灌注入結(jié)腸內(nèi)[4]；用降解的1%角叉菜膠水溶液飼喂動物,數(shù)周后實(shí)驗(yàn)動物可導(dǎo)致UC。[5]；基因敲除和轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)炎癥性腸病模型[6]。盡管這些誘導(dǎo)方法能夠模擬當(dāng)今人們的病理狀態(tài)，但因考慮因素多、操作復(fù)雜，不易控制，病變自愈能力不同、維持時間不一，重復(fù)性差，死亡率高等，造模參數(shù)各異。

3. 技術(shù)難點(diǎn)

（1）硅膠管或聚乙烯導(dǎo)管的選擇。本實(shí)驗(yàn)室采用硅膠管或聚乙烯導(dǎo)管，長度為12cm，內(nèi)徑為2mm。既保證了能夠伸入到大鼠結(jié)腸部位，又能保證不會對大鼠結(jié)腸造成另外物理傷害。為造模成功提供了基礎(chǔ)。

（2）造模時長的選擇。綜合了前期文獻(xiàn)調(diào)研和本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，采用造模兩次刺激，保證造模液完全被腸腔吸收，而非隨糞便排除。

（3）糞便隱血檢測評分。以空白組顏色以及改變時間做對照。

4. 創(chuàng)新性

（1）造模兩次刺激，保證造模液完全被腸腔吸收，而非隨糞便排除。 可以建立更穩(wěn)定、更有效的動物疲勞模型。

（2）揭示了炎癥性腸病與PPAR γ 有關(guān)。PPAR γ 參與炎癥及免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抗炎的作用。

5. 應(yīng)用價值

采用TNBS乙醇溶液灌腸的方法，對動物麻醉后進(jìn)行灌腸而造成炎癥性腸病，能夠很好模擬當(dāng)今社會人們所處的工作環(huán)境、生活狀態(tài)等因素而引起的炎癥性腸病：如生活方式生活習(xí)慣的改變、腹痛腹瀉、腸道菌群紊亂、免疫持續(xù)激活以及工作和生活所帶來的生理和心理壓力等等。因此，該模型為緩解IBD腹痛腹瀉、便血的功效評價提供了一個已操作、穩(wěn)定可控的動物模型。

動物飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所的屏障環(huán)境，12 h 照明/12 h 黑暗( 照明: 8: 00-20:00) ，飼養(yǎng)期間給予動物標(biāo)準(zhǔn)飼料和潔凈飲水。本動物實(shí)驗(yàn)遵守國際實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求。

（一）TNBS乙醇灌腸致大鼠炎癥性腸病的分子機(jī)制

1實(shí)驗(yàn)材料 1.1試劑耗材

TRIzol（Solarbio, China）；磷酸酶抑制劑（CWBIO, China）；蛋白酶抑制劑（CWBIO, China）；RIPA裂解液（Solarbio, China）；BCA 蛋白質(zhì)檢測試劑盒（Solarbio, China）；廣譜彩虹預(yù)染蛋白Maker（CWBIO, China）；T-bet、RORy t、Foxp 3

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

超聲破碎儀（Sonics, USA）、小型垂直電泳儀（Bio-Rad, USA）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad, USA）。

2實(shí)驗(yàn)方法 2.1動物實(shí)驗(yàn)及取材方法

動物實(shí)驗(yàn)及過程如前所述。

2.2轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

使用TRIzol（Solarbio, China）從對照組和IBD大鼠中提取總RNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。使用NanoDrop和Agilent 2100對RNA質(zhì)量進(jìn)行評估，然后使用Illumina測序平臺（HiSeqTM4000）對RNA進(jìn)行測序。通過HTSeq對各基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，然后從負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)得到p值，并使用FDR (BH)進(jìn)行調(diào)整。差異表達(dá)基因(DEGs)篩選的標(biāo)準(zhǔn)為p值小于0.05。

2.3蛋白質(zhì)印跡分析

將大鼠結(jié)腸組織勻漿，并在含有 1% 磷酸酶和蛋白酶抑制劑混合物（CWBIO, China）的RIPA（Solarbio, China）中裂解。使用 BCA 蛋白質(zhì)檢測試劑盒（Solarbio, China）對勻漿中的蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量，并調(diào)整至相同濃度。將蛋白在100℃水浴中加熱5 min使蛋白變性，并保存與-80℃。

上樣25-50 ug 變性蛋白質(zhì)和3 ul廣譜彩虹預(yù)染蛋白Maker（CWBIO, China）進(jìn)行電泳。之后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜（0.2 μm）上。膜在5%脫脂牛奶中封閉1.5小時，并在4℃下孵育特異性一抗過夜。隨后，在室溫下孵育二抗（CWBIO, China）1.5 h（山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG H&L，在1：5000稀釋）。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光方法在凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad, USA）中曝光，使蛋白質(zhì)表達(dá)可視化。最后將蛋白條帶強(qiáng)度與相應(yīng)的總蛋白或 GAPDH比進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

2.4組織病理和免疫組織化學(xué)分析

將大鼠結(jié)腸組織用4%多聚甲醛緩沖液固定24 h，然后用石蠟包埋。切下5 um厚的結(jié)腸切片，并用蘇木精和伊紅（H&E）染色。

2.5數(shù)據(jù)分析

使用 ImageJ 軟件（1.8.0, National Institutes of Health, USA）對蛋白條帶進(jìn)行定量。使用t檢驗(yàn)分析兩組數(shù)據(jù)之間的差異。使用單因素方差分析用于兩組以上的比較。當(dāng)數(shù)據(jù)偏離正態(tài)分布時，使用非參數(shù)檢驗(yàn)。使用 SPSS 25.0軟件（IBM Corp., USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。 所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM），以p < 0.05判斷為顯著。 使用 GraphPad Prism 7.0（USA）繪制圖形。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.1 TNBS乙醇溶液灌腸致大鼠腸上皮細(xì)胞炎癥浸潤

為了研究TNBS乙醇溶液灌腸誘導(dǎo)大鼠IBD發(fā)生的機(jī)制，我們對與胃腸道運(yùn)動相關(guān)的結(jié)腸組織進(jìn)行了研究。對TNBS乙醇溶液灌腸造模后，HE染色觀察結(jié)腸組織形態(tài)，空白對照組結(jié)腸組織切片中，黏膜上皮細(xì)胞排列整齊緊密，模型組炎性細(xì)胞嚴(yán)重浸潤，杯狀細(xì)胞缺失。上述表明，TNBS乙醇溶液灌腸造模可造成大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)破裂、炎癥介質(zhì)浸潤。

3.2 IBD大鼠結(jié)腸轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

為了系統(tǒng)地研究TNBS乙醇溶液灌腸對大鼠結(jié)腸部位產(chǎn)生的影響，通過轉(zhuǎn)錄組測序分析了對照組和TNBS乙醇處理大鼠的結(jié)腸。在對照組與模型組中共發(fā)現(xiàn)了x個差異表達(dá)基因（DEGs）。其中模型組顯著上調(diào)了195個基因，顯著下調(diào)了44個基因(圖8a)。KEGG富集分析結(jié)果表明。。基于KEGG結(jié)果的熱圖顯示，x信號通路、基因均受到TNBS處理的顯著調(diào)控(圖8b)。GO分子功能分析表明，；細(xì)胞成分分析顯示，；并且在生物過程中也富集了許多x過程相關(guān)的代謝途徑(圖8d)。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，TNBS乙醇致大鼠炎癥性腸病的原因與。。有關(guān)，并與。。AMPK信號通路密切相關(guān)。

圖8 通過RNA-Seq分析TNBS乙醇對大鼠結(jié)腸基因表達(dá)的影響（mean ± SEM，n=3）。（a）結(jié)腸中x個特異性DEGs的火山圖；（b）DEGs的KEGG富集分析；（c）信號通路相關(guān)的DEGs表達(dá)熱圖; （d）DEGs的GO富集分析。

3.3 TNBS乙醇誘導(dǎo)IBD結(jié)腸組織炎癥、潰瘍與PPAR γ

PPAR γ 參與炎癥及免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，作為巨噬細(xì)胞的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抗炎的作用。PPAR γ 配體抑制免疫、炎癥反應(yīng)可能與抑制 IκB 磷酸化有關(guān)。PPAR γ 激活有助于下調(diào) Th1 細(xì)胞因子(INF-γ、 TNF-α)，上調(diào) Th2 細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)，調(diào)節(jié) T 細(xì)胞分化。

4小結(jié)

本研究證明了IBD大鼠的炎癥與過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR γ）有關(guān)。TNBS乙醇溶液誘導(dǎo)的炎癥性腸病是由于免疫激活而引起的，這主要與PPAR γ/T細(xì)胞調(diào)節(jié)有關(guān)。通過調(diào)控PPAR γ/NF-κB信號通路，釋放炎性因子，調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化，導(dǎo)致炎癥性腸病發(fā)生。這些證據(jù)為治療TNBS乙醇溶液誘導(dǎo)炎癥性腸病提供了思路。

（二）以美沙拉嗪為陽性藥，對戊己丸治療IBD大鼠的功效進(jìn)行評價驗(yàn)證

1實(shí)驗(yàn)材料 1.1實(shí)驗(yàn)動物

SD雄性大鼠60只，6周齡，體重220-240 g，購自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：CXK（京）2021—0011、SCXK（京）2021—0006。動物購入后于SPF級動物中心飼養(yǎng)。保持飼養(yǎng)環(huán)境安靜，室溫22-25℃，濕度50%-60%，明暗交替周期12 h/12 h。整個實(shí)驗(yàn)過程中大鼠可自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

TNBS（sigma）；糞便隱血試劑盒（雷根生物）；戊巴比妥鈉（sigma）；炎性因子Elisa試劑盒。陽性藥“美沙拉嗪”。戊己丸（李時珍醫(yī)藥集團(tuán)有限公司）

酶標(biāo)儀（Thermo scientific）。

2實(shí)驗(yàn)方法 2.1動物分組、造模及給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)4天，根據(jù)體重將動物隨機(jī)分為5組，即空白對照組、模型組、陽性藥組、戊己丸低劑量組和高劑量組，每組10只。

空白對照組使用生理鹽水，其余各組均使用TNBS乙醇溶液灌腸刺激以建立大鼠IBD模型。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水 24h，稱重，腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉；用直徑 2.0 mm 長 12 cm 的輸液管經(jīng)液體石蠟潤滑后,通過肛門輕 輕插入結(jié)腸至標(biāo)記好的 8 cm 處，一次性緩慢推入新鮮配制的 TNBS 造模溶液(150 mg/kg TNBS+50%乙醇，體積比 2:1),捏緊肛門提尾倒立 1-3 min，以避免造模液 回流，同時輕揉鼠腹，保持動物臀部高于腹部 15 min。最后，使大鼠側(cè)臥，放回 籠中自然蘇醒,之后常規(guī)飼養(yǎng)。

造模造模 24h 后給藥，陽性藥物組和戊己丸各劑量組灌胃相應(yīng)劑量的藥物，空白對照組、模型組灌胃等量飲用水，給藥x天后，進(jìn)行檢測。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.1戊己丸對IBD大鼠體重的影響

結(jié)果如圖所示，與空白對照組相比，模型組大鼠在TNBS乙醇溶液處理后模型大鼠精神狀態(tài)萎靡不振，在2-4天體重將發(fā)生一定程度的降低。之后大鼠體重開始呈現(xiàn)穩(wěn)定增長，但仍然顯著低于空白組，且戊己丸給藥組的低和高劑量組與模型組相比有顯著性差異。

3.2戊己丸對IBD大鼠DAI評分的影響

在整個實(shí)驗(yàn)過程中，與空白對照組相比，模型組大鼠在TNBS乙醇溶液刺激后DAI 評分顯著降低。戊己丸和美沙拉嗪給藥各組較模型組DAI評分有所升高。

3.3戊己丸對IBD大鼠相關(guān)生化指標(biāo)的影響

在造模給藥后，與空白對照組相比，模型組小鼠在TNBS乙醇溶液刺激后血清中炎性因子IL-1β、TNF-α顯著升高。戊己丸和美沙拉嗪給藥各組較模型組炎性因子有一定程度的降低。

4小結(jié)

在TNBS乙醇溶灌腸模型上，研究發(fā)現(xiàn)戊己丸給藥后可以顯著改善TNBS乙醇所致的DAI評分降低、炎癥因子升高。本研究證明了戊己丸的改善嚴(yán)重性腸病藥效，也驗(yàn)證了TNBS乙醇溶灌腸模型評價治療IBD功效的有效性。

1實(shí)驗(yàn)材料 1.1實(shí)驗(yàn)動物

SD雄鼠10x2=20只（購自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司），6周齡，體重220-240g，許可證號：SCXK（京）2021—0011、SCXK（京）2021—0006。動物購入后于SPF級動物房中飼養(yǎng)。自由進(jìn)食給水，保持實(shí)驗(yàn)室安靜，實(shí)驗(yàn)室溫度22-25oC，濕度50-60%，明暗周期12h/12h。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

TNBS（sigma）、糞便隱血試劑盒（雷根生物）、

戊巴比妥鈉（sigma）

2實(shí)驗(yàn)方法 2.1分組及實(shí)驗(yàn)

適應(yīng)性飼養(yǎng)4d，根據(jù)體重將動物隨機(jī)分為以下2組（n=10）。1組為空白組，1組為模型組。各組動物于同一天進(jìn)行解剖取材。

實(shí)驗(yàn)期間記錄大鼠體重，3周后進(jìn)行取材。

2.2DAI 評分 2.2.1體重變化

每日密切觀察大鼠動物狀態(tài)，稱重，記錄體重。

2.2.2糞便形態(tài)

大鼠每天觀察大鼠糞便形態(tài)，記錄，包括：正常、軟便、便不成型、粘液狀。

2.2.3糞便隱血檢測

觀察大鼠糞便顏色是否有血，將無明顯顏色變化的大鼠糞便進(jìn)行糞便隱血檢測，并記錄結(jié)果。

2.3取材及生化檢測

在戊巴比妥鈉麻醉下取血、結(jié)腸組織用于后期生化指標(biāo)測量。取得血靜置4h后，3500r/ min，15min離心得血清。對結(jié)腸組織劑型直觀觀察，對結(jié)腸黏膜損傷情況進(jìn)行評分；稱重，測量結(jié)腸組織重量及長度。

結(jié)腸組織立即用 4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水、二甲苯透明，然后進(jìn)行浸蠟、包埋、切片、脫蠟、染色、脫水、透明、封片等步驟。蘇木精-伊紅染色后，在顯微鏡下觀察各組結(jié)腸組織形態(tài)的病理學(xué)變化并拍照。使用ELISA 試劑盒（IL-6、IL-1β、TNF-α），按照試劑盒內(nèi)說明書方法操作對血清中炎癥因子進(jìn)行檢測。

2.4數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SEM）表示，采用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P < 0.05為產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1. 目的

通過化學(xué)誘導(dǎo)的方法，構(gòu)建能夠很好模擬當(dāng)今社會人們所處的工作環(huán)境、生活狀態(tài)等因素而引起的炎癥性腸病：如生活方式生活習(xí)慣的改變、腹痛腹瀉、腸道菌群紊亂、免疫持續(xù)激活以及工作和生活所帶來的生理和心理壓力等等，以用于改善炎癥性腸病藥品和保健品的功效評價。

2. 意義

隨著社會的進(jìn)步和高速發(fā)展，人們的生活節(jié)奏及生活方式發(fā)生改變，家庭遺傳因素，免疫持續(xù)激活，腸道內(nèi)菌群紊亂，腸粘膜屏障防御功能減弱等因素影響，身體出現(xiàn)腹痛、腹瀉、便血、體重減輕等癥狀。當(dāng)今，炎癥性腸病發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重影響患者的自我效能，降低生活質(zhì)量，已成為不容忽視的健康問題。隨著生活水平的提高，人們對保健品和藥品的需求也在不斷增大，通過服用具有緩解腹痛腹瀉的保健品和減輕炎癥損傷的藥品可以降低或消除機(jī)體腹痛腹瀉、便血的現(xiàn)象，使其體力恢復(fù)到正常。因此，建立穩(wěn)定的炎癥性腸病動物模型和功效評價方法就顯得尤為重要。目前常用的方法是采用正常動物通過化學(xué)誘導(dǎo)炎癥性腸病（IBD）模型。本研究采用化學(xué)誘導(dǎo)模型，即TNBS乙醇溶液灌腸的方法，造成動物腸粘膜局部免疫紊亂的狀態(tài)，能很好地模擬當(dāng)今人們因長期免疫應(yīng)激所導(dǎo)致的炎癥性腸病狀態(tài)，如腹痛腹瀉、便血、以及工作和生活所帶來的生理和心理壓力等。該類模型具有快速誘導(dǎo)炎癥、易操作性和花費(fèi)少的特點(diǎn)。

3. 國內(nèi)外研究進(jìn)展

國內(nèi)外文獻(xiàn)中已報道的造成炎癥性腸病動物模型的方法有：化學(xué)誘導(dǎo)、免疫和炎癥、大腸桿菌誘導(dǎo)等單一因素或多種因素誘導(dǎo)的方法構(gòu)建的一系列用于炎癥性腸病研究的動物模型[1]。而在這些方法中，化學(xué)誘導(dǎo)是最為常用的造成炎癥性腸病的方法，如飲用DSS、TNBS灌腸、惡唑酮皮膚表面滴注及灌腸等。如：I Okayasu等對小鼠予飲用水中添加一定分子量的DSS，就可導(dǎo)致不同程度的炎癥性腸病模型[2]；取4%~10%的乙酸1.5 mL灌入大鼠結(jié)腸內(nèi)5~8 cm處，10~20 s后用0.9%氯化鈉3~5 mL沖洗1次[3]；取一定量的OXZ乙醇溶液一次性經(jīng)導(dǎo)管(距肛4 cm)灌注入結(jié)腸內(nèi)[4]；用降解的1%角叉菜膠水溶液飼喂動物,數(shù)周后實(shí)驗(yàn)動物可導(dǎo)致UC。[5]；基因敲除和轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)炎癥性腸病模型[6]。盡管這些誘導(dǎo)方法能夠模擬當(dāng)今人們的病理狀態(tài)，但因?yàn)椴∽冏杂芰Σ煌⒕S持時間不一，重復(fù)性差，死亡率高等，造模參數(shù)各異。

我們采用SD雄性小鼠，禁食24小時后麻醉，用長約15 cm，直徑2 mm的硅膠管 (或聚乙烯導(dǎo)管) 由肛門輕緩插入8 cm處的腸腔內(nèi)，注入50~150 mg/kg的30%~50%TNBS乙醇溶液，約2小時大鼠蘇醒前，再次用造模液刺激，用膠帶封住肛門部位，使造模液全部被腸腔吸收。表現(xiàn)在造模后2-4天體重連續(xù)下降、糞便松軟、且?guī)а螂[血、精神狀態(tài)萎靡、自主活動減弱。

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